以下是赛默飞UltiMate3000高效液相色谱仪的使用流程及注意事项:
1. 准备工作
检查设备:检查设备电源、流路、信号连接是否完好。
准备流动相:按照分析方法配制相应的流动相,用0.45μm微孔滤膜抽真空过滤后,超声脱气15分钟。必须使用色谱纯的溶剂,水或缓冲盐溶液要用超纯水,盛放样品溶液和流动相所用的玻璃容器必须用超纯水清洗。
准备样品溶液:按方法取样或配制标准样品溶液,0.45μm滤膜过滤。
2. 开机与平衡系统
开启仪器:依次接通Ultimate3000分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通Ultimate3000分离单元后,仪器开始自检约20s,打开电脑,双击电脑右下角的变色龙软件的服务管理器,单击“启动 Chromeleon仪器控制器”,激活服务管理器,双击电脑桌面的“ Chromeleon 7”图标,进入变色龙软件。
管路排气:向上掀开泵头前面板,拧松快速清洗阀(逆时针两圈左右),然后按“冲洗”键,泵将以3.0ml/min的速度自动快速清洗泵类残留的气泡,5min将自动停止。若想手动停止,只要再按“冲洗”键,将停止清洗。
安装色谱柱:注意安装方向,用滤纸检查是否漏液。
设置流动相比例:平衡色谱柱。
3. 编辑仪器方法
创建仪器方法 :在Chromeleon Console“创建”菜单中点击“仪器方法”,设置采集时间和采集通道。
设置泵参数:在溶剂名称下面的方框中输入所用流动相的名字,设置压力限值,最大流速加速度和减速度等。
设置流速梯度 :在“流速梯度”窗口中,输入相应值。
设置自动进样器 :一般吸取速度设为2μl/s,吸取延迟为7s,排出速度为10μl/s,取样高度为2mm,进样冲洗设置为Before Inject,冲洗体积75μl,冲洗速度4μl/s。
设置进样模式 :分析型液相色谱一般采用默认设置,低压梯度泵需勾选“与泵同步进样”。
设置柱温箱:若需对色谱柱进行精确控温,则勾选“使用温度控制”,然后在“温度”后输入需要的温度值。
设置检测器 :二极管阵列检测器可以同时选择4个紫外通道采集数据,可以分别设定需要的检测波长,需要采集3D光谱时要选上3D FIELD,常规分析时可以选一个通道采集数据,一般参比波长选 FF,数据采集频率和相应时间可以通过勾选“使用推荐值”来设置。
4. 创建处理方法和报告模板
创建处理方法:在 Chromeleon Console“创建”菜单中点击“处理方法”,选择基本定量,输入方法名称并保存。
创建报告模板:在 Chromeleon Console“创建”菜单中点击“报告模板”,选择相应的检测器类型,输入报告模板名称并保存。
5. 创建序列文件
新建序列:在 Chromeleon Console“创建”菜单的下拉菜单中点击“序列”,在弹出的“新建序列向导”页中,依次在“进样名称的格式”、“样品数”、“进样次数”、“开始位置”、“进样量”输入相应值,点击下一步。
选择方法和模板:点击“浏览”为新建的样品序列选择分析时所要采用的仪器方法、处理方法和报告模板。
保存序列:最后输入序列名称并选择保存路径,点击完成。
6. 样品分析
平衡仪器:测试样品前必须先平衡仪器,走稳仪器。点击 Chromeleon Console工具栏的“监视基线”,在弹出的“选择监视通道”窗口勾选所需的监视波长和通道,待基线平稳后(约20 30min),再次点击工具栏的“监视基线”立即停止采集。
自动进样器进样:在仪器状态栏“新建”右边点击“开始”进行样品分析。
手动进样阀进样:单击“开始”,将手动进样阀反时针扳到头之后,将样品用进样针注入定量环,注入完成后,将进样阀顺时针搬到头,即开始采集数据。
7. 数据报告打印
导出数据:在数据处理界面,右击已完成分析的样品,选择“导出”,在弹出的选项卡中依次选择报告模板路径和导出文件格式,点击确定即可。
8. 关机
冲洗系统:使用完毕后,按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进样器、进样针和柱塞杆密封垫。
智能关机:在序列的最后一个样品栏可设置关机程序,或手动依次关闭各单元电源,关闭计算机,填写仪器使用记录。
注意事项
1. 流动相准备 :流动相要使用0.45μm滤膜过滤除去微粒杂质后,超声脱气5分钟。甲醇、乙腈要使用色谱纯级别,配制缓冲盐溶液要用超纯水,夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。
2. 管路排气 :确保流动相应连续、无气泡。排气泡前要打开排气阀,排完后也要记得关。
3. 色谱柱安装 :安装好色谱柱,注意安装方向,用滤纸看看是否漏液。
4. 进样器清洗 :清洗进样器,灌注注射器,清洗缓冲环,清洗针等,最后进样针回到进样位置“T Inject P siti n”。
5. 样品处理 :样品溶液需用0.45μm滤膜过滤,确保样品纯净无杂质。
6. 维护保养 :定期检查设备的各个部件,确保其正常运行。定期清洗泵头和管路,防止堵塞。
7. 缓冲盐流动相使用 :使用了缓冲盐流动相之后,要先用纯水清洗色谱柱,然后再改成有机相清洗,防止盐与有机相混合产生结晶析出而堵塞色谱柱。因此,清洗柱子的方法用梯度洗脱,高比例水相如5% 10%甲醇溶液冲洗30min,然后改成100%甲醇冲洗45min。
8. 检测器维护 :对于异常峰和方形峰以及噪声异常增大现象,表示光源灯已到极限,应更换并检查上述现象是否消失。若流动相被污染,也会出现异常峰和方形峰的情况。流动相内混有气泡可出现流动池内有气泡的现象,气泡去除方法:一面由泵送液,一面用手指紧压流动池出口的连接管,使池内增压,如此反复3 4次,气泡即可冲走。注意不应使流动池压力增加太多,以免破裂。流动池漏液或池出口反压过大,环境温度起落大(如直接有风吹在示差折光检测器上),都可能发生流动池漏液或压力异常。
9. 流动相与色谱柱维护
避免盐析与腐蚀:含缓冲盐的流动相不可过夜存放,使用后立即冲洗系统。强酸(pH<2)或强碱(pH>8)会破坏硅胶柱基质。
色谱柱保护:使用保护柱拦截杂质,定期反冲强溶剂(如异丙醇 二氯甲烷)清除污染物。保存时需充满乙腈或甲醇,禁止残留缓冲液。
10. 泵与检测器维护
泵头清洗:每周用稀硝酸超声清洗入口过滤头,避免颗粒堵塞。
氘灯寿命管理:检测结束后及时关灯,避免频繁开关(间隔≥5分钟)。
11. 进样与样品处理
样品预处理:需完全溶解于流动相,过滤(0.22 μm)去除颗粒。生物样品需去蛋白(如乙腈沉淀法)。进样量控制:250×4.6 mm色谱柱的绝对进样量≤100 μg,避免超载导致峰畸变。
12. 环境与操作规范
温度与湿度:柱温箱控温误差±0.1℃,实验室湿度建议30–70%。
避免机械冲击:色谱柱安装需轻缓,禁止反冲(除非厂家允许)。
三、常见问题解决
基线漂移:检查流动相脱气是否充分或色谱柱污染,必要时冲洗柱。
压力异常:可能因过滤头堵塞或色谱柱污染,需清洗或更换部件。
峰形拖尾:酸性样品可添加1%醋酸,碱性样品添加10–20 mM三乙胺改善。
总结
UltiMate3000的操作核心在于 流动相规范处理、系统彻底冲洗及色谱柱保护 。严格遵循开机 平衡 进样 关机的流程,并定期维护泵、过滤器和检测器,可显著延长仪器寿命并保障数据准确性。具体细节可参考赛默飞官方手册或联系技术支持。